Vector Shuttle: o plasmídeo integrativo

Se quisermos obter uma determinada proteína a partir da molécula de DNA a clonar, tornasse necessário utilizar outros organismos para além da E. coli. Isto, levanta no entanto problemas, uma vez que, as técnicas de recombinação em organismo como leveduras são, usualmente, mais complicadas comparativamente ao uso em bactérias. Para resolvermos esta questão, surge oplasmídeo integrativo: plasmídeo que é recombinado num organismo e transformado num outro.

A presença do gene ori da E. coli, possibilita a construção do plasmídeo recombinante antes de ser transferido para as células de leveduras. Isto é, os genes são clonados nas bactérias (pela acção da mesma enzima de restrição, adicionamos o fragmento de DNA de interesse ao vector) e transformados em leveduras. Esta integração é conseguida pelo gene URA3 através de umarecombinação homóloga.

Para facilitar a transformação, as leveduras são utilizadas como protoplasto. Isto é, são cultivadas em meio de cultura sem a sua parede celular. Para além disto, apresentam o gene URA3 mutado ( ), para ser possível separar as leveduras clonadas das não clonadas.

Este vector integrativo apresenta:

• Gene URA3: este gene possibilita a recombinação homóloga entre o vector da bactéria e um cromossoma da levedura. No momento da recombinação homóloga, o cromossoma da levedura (ao alojar o plasmídeo recombinante) ficará com um locus para o URA3 funcional e outro mutado. As leveduras com o DNA recombinante ( /URA3 e URA3/URA3) são assim separadas das leveduras onde não ocorreu recombinação homóloga ( / ), fazendo-as crescer em meio mínimo em uracilo (só as leveduras recombinantes vão conseguir dividir-se e crescer).
• Gene que confere resistência à ampicilina e à tetraciclina: utilizados como marcas de selecção. Isto, permite diferenciar as bactérias que apresentam o vector plasmideal das que apresentam os plasmídeos normais, fazendo crescer as bactérias em meio rico em ampicilina e tetraciclina.
• Ori: permite que o gene seja replicado como DNA plasmideal na bactéria. Isto, vai permitir que a partir das sucessivas divisões de bactérias seja possível obtermos grandes quantidades do vector e, apartir disto, purifica-los para posteriormente transformá-los em bactérias.

YAC’s ( Cromossomas Artificiais de Leveduras):

São cromossomas obtidos “artificialmente” a partir de plasmideos que se propagam em leveduras (como a S. cerevisiae) e representam a primeira tentativa para introduzir moléculas de DNA acima dos 50 pares de bases. Porém, estão associados a um enorme problema de estabilidade e a possibilidade de sofrerem rearranjos, originando novas combinações.

Um cromossoma é caracterizado por:

• Telómeros: sequências específicas que ditam o fim da molécula de DNA.
• Centrómeros: importantes na divisão celular.
• Origem de Replicação: ditam o inicio da replicação da molécula de DNA a cada divisão do cromossoma.

O YAC, apresenta:

• Local de ligação para enzima de restrição BamHI: como existe um local de ligação para esta enzima de restrição, após o corte na molécula circular, terá origem uma molécula de DNA linear.
• Gene URA3 e TRP: são genes presentes na biossíntese de compostos (Uracilo e Triptofano). Isto, irá funcionar como uma marca de selecção para separarmos as leveduras com os vectores das que não apresentam o vector. Isto é, ao fazermos as leveduras crescerem em meio mínimo de uracilo e triptofano e, uma vez que as leveduras sem o vector não apresentam os genes URA3 e TRP funcional, apenas irão crescer no nosso meio de cultura bactérias que contenham o vector (recombinante ou não).
• Gene SUP4 com local de ligação para a enzima de restrição: este gene será a marca de selecção para separar os vectores que contem os fragmentos de restrição dos restantes. Isto é, se cortarmos uma determinada molécula de DNA de interesse com a mesma enzima de restrição para qual o SUP4 possuí um local de ligação, estaremos a promover uma inibição por excerto. Isto é, com a inserção da sequência de interesse, o gene SUP4 irá perder a sua funcionalidade, sendo possível então por métodos colorimétricos diferenciar dos que tem o gene SUP4 activo (sem o fragmento de restrição).
• Ori: origem de replicação para que o cromossoma artificial tenha a capacidade de ser replicar a cada divisão da levedura.
• CEN4: origina o centrómero essencial para a correcta constituição do cromossoma.
• TEL: origina os telómeros que farão parte do cromossoma artificial.

Vectores de Bacteriófagos λ:

A quando o fenómeno da infecção (transfecção) do DNA do fago para o interior da bactéria, este pode seguir dois ciclos de vidas diferentes: ciclo lítico e ciclo lisogénico.

• Ciclo de vida lítico: o DNA ao ser transfectado para o interior da bactéria não irá sofrer a integração no genoma da mesma e, como tal, irá utilizar o metabolismo da bactéria para sintetizar proteínas que irão compor o fago. Isto, leva a que, ao fim de uma divisão celular ocorra a formação e a libertação (lise da célula) dos mesmos.
• Ciclo de vida lisogénico: o DNA ao ser transfectado será introduzido no genoma da bactéria e, como tal, será replicado ao longo das sucessivas divisões, juntamente com todo o material genético da bactéria (de geração em geração). Após isto, o ciclo de vida lisogénico é terminado pela utilização dos “processos” descritos no ciclo de vida lítico, resultando numa libertação massiva de bacteriófagos.

No ponto de vista da Eng. Genética, seria muito mais vantajoso se fosse possível direccionar o ciclo de vida para uma fase lítica, de forma a obter o máximo de fagos (com o DNA recombinante) no menor tempo possível. Isto é possível através da eliminação do gene que confere a incorporação do DNA do fago no genoma da bactéria, na sequência que representa o genoma do Bacteriófago λ. Esta técnica, para além de “direccionar” o ciclo de vida, torna possível a inserção de uma maior molécula de DNA (comparativamente aos vectores de plasmídeos).

O genoma de λ para além de ser uma molécula linear, apresenta fins coesivos (cos sites), característica “diagnóstica” do DNA viral. Como estas pontas apresentam propriedades coesivas, dependendo da forma como se liguem, podem originar: concatámeros (molécula de DNA linear) e os cósmidos (molécula de DNA circular).

Formação de concatámeros:

Como referido anteriormente, a molécula de DNA λ possuí a forma linear e, quando tratada com uma determinada enzima de restrição, será clivada originando “Left cos site” e um “Right cos site”. Por sua vez, se fizermos um corte na molécula que queremos recombinar, utilizando a mesma enzima de restrição e pela acção das ligases é possível formar: Left cos site – DNA interesse – Right cos site. Por sua vez, como cada sequência apresenta fins coesivos entre si, é possível originar um fragmento de DNA em que o gene que pretendemos clonar, surge de sob a forma de cópias múltiplas e sequencial, intercalado com os diferentes “cos site”:

Left cos site- DNA – Right Cos site – Left cos site – Right cos site – DNA – Left cos site

A propriedade “cos site” é de extrema importância na utilização do vector de bacteriófago, uma vez que, promove a formação espontânea de fagos in vitro a partir de proteínas que constitutem a cápsula (empacotamento in vitro.).

A quando do empacotamento in vitro ocorre uma clivagem do fragmento de DNA λ , de modo a que: todas as sequências de DNA que eles empacotem sejam recombinada (Left cos site – DNA – Right cos site) uma vez que a sequência Left cos site – Right cos site é pequena de mais para sofrer o empactomento. É então possível definir que um fragmento de DNA só pode ser empacotado in vitro se: conter em cada terminal um cos site e for composto por 37 a 52 pares de base.

Após a transfecção dos vírus para o interior das bactérias, devemos proceder ao plaqueamento da suspensão (bactérias + vírus) para uma placa de petri, formando assim uma camada homogénea de bactérias. Neste ponto, devemos ter em consideração que:

• Zonas onde não há formação de placas fágicas: não há presença do DNA λ, uma vez que, não ocorreu lise celular.
• Zonas onde há formação de placas fágicas: surgem como “pontuações” onde ocorre lise celular e, como tal, estaremos na presença de DNA λ. A partir destes discos “brancos” é possível extrair e purificar inúmeras cópias do DNA recombinante.

Formação de cósmidos:

O cósmido é uma molécula de DNA circular que é obtida a partir do genoma de λ. Isto é, os cos sites em vez de se complementarem com outros fins coesivos, após a recombinação com um fragmento de DNA de interesse (utilizando a mesma enzima de restrição em ambos os cortes) vão ligar-se entre si, formando uma molécula de DNA circular contendo o gene de interesse e um locus cos site.

Esta, como apresenta cos site pudera sofrer o empacotamento in vitro originando fagos λ contendo a moléucula de DNA circular “recombinada”. Porém, como esta molécula é de grandes dimensões não será tida em conta como um fragmento de DNA viral, sendo no entanto, mantida no citoplasma como DNA plasmideal.

De salvaguardar que, este plasmídeo é diferente do vector plasmídeal utilizado em bactérias, uma vez que apresenta a possibilidade de inserção de um fragmento de maiores dimensões comparativamente a um vector bacteriano.

Clonagem

De uma forma generalista, podemos designar por clonagem a inserção de uma molécula de DNA de um organismo noutro organismo diferente. Como tal, surge a necessidade de definirmos o que se trata de DNA recombinante.

O DNA recombinante resulta da habilidade de controlar técnicas de biologia molécular (cortes por enzimas de restrição e ligases) de modo a criar uma molécula de DNA “manipulada”. Podemos definir o DNA recombinante como uma molécula de DNA resultante de duas completamente distintas.

Uma sequência de um gene animal, por exemplo, e um plasmídeo são tratados com a mesma enzima de restrição. Isto, vai resultar na formação de fins coesivos “complementares” entre as diferentes moléculas de DNA. De seguida, pela acção de ligases é possível criar ligações fosfodiester estáveis entre os dois genes e criar assim uma única molécula de DNA (a partir dos dois fragmentos).

De seguida, esta molécula de DNA recombinada e circular pode ser transferida (transformada) para o interior de um organismo (uma bactéria, por exemplo) de modo a ser replicada e aumentar o seu número. Se, plaquearmos esse mesmo microorganismo, irão originar-se colónias (por divisões a partir de um único organismo) na qual poderemos obter grandes quantidades do gene recombinado.

Podem procurar mais informação em: T.A. Brown: Genomes 3, Garland Science.

DNA Ligase

As DNA’s ligases são enzimas que apresentam a capacidade de formar ligações fosfodiester estáveis entre diferentes nucléotidos (entre o Carbono 5 de um e o C3 do seguinte), com o consumo de ATP (ou outro composto com três fosfatos como: GTP,CTP e TTP), tornando a reacção termodinâmicamente favorável. De salvaguardar que, por razões de estabilidade, a acção desta enzima é favorecida quando o substrato é composto por duplas cadeias de DNA.

Estas enzimas, tem a capacidade de funcionar numa única molécula de DNA e ligar as duas extremidades da mesma, formando uma molécula de DNA circular. Por outro lado, tem a capacidade de ligar dois fragmentos distintos de DNA (sendo muito utilizado para a formação de DNA recombinante).

A aplicação desta enzima é copulada à acção das enzimas de restrição (“copy past” molecular), uma vez que as DNA ligases tem a capacidade de ligar dois cortes produzidos pela mesma enzima de restrição. Contudo, uma vez que as DNA’s ligases não apresentam a capacidade de “carregar” os fragmentos de DNA e manter-los em posições favoráveis para criar as ligações fosfodiester entre os diferentes nucleótidos, a sua acção tenderá a ocorrer mais facilmente fragmentos de DNA coesivos (por estarem fisicamente próximos por complementaridade de bases “transitórias”) do que em fins lisos (“blunt-ends”).

Como nem sempre é possível obtermos fragmentos de DNA com fins coesivos (pela acção de uma enzima de restrição), tiveram de ser criadas formas de, indirectamente, converter os fins lisos a fins coesivos: Modificadores terminais.

• Linkers: fragmentos de DNA de cadeia dupla na qual estão contidos locais de ligação (sequências de nucleótidos específicas) para uma dada enzima de restrição. Se, utilizarmos as DNA ligases para ligar os “linkers” aos blunt-ends e, de seguida, aplicarmos a enzima de restrição para o qual o linker tem um local de ligação, o nosso fim liso será “convertido” a um fim coesivo.
• Transferase Terminal de Desoxinucleótidos: produz caudas “homopoliméricas” (compostas pelo mesmo tipo de nucleótidos) à extremidade 3’ do blunt-end. É designada por “cola molecular”, uma vez que por complementaridade de bases, apresenta a capacidade de emparelhar com diferentes caudas homopoliméricas.
• Fosfatase Alcalina: remove grupos fosfatos na extremidade 5’ de um determinado fragmento de DNA. É de extrema importância, uma vez que pode “regular” a actividade da DNA ligase. Isto é, se no C5 de um determinado nucleótido estiver presente um grupo fosfato, a DNA ligase não vai conseguir formar uma ligação fosfodiester estável entre dois fragmentos de DNA.
• Cinase Nucleótidica T4: faz precisamente a reacção inversa da fosfatase alcalina (adição de grupos fosfato ao C5 de um nucleótido terminal).

Podem procurar mais informação em: T.A. Brown: Genomes 3, Garland Science.

Nucleases: Endonucleases (Enzimas de restrição)

As nucleases são enzimas conhecidas por degradas ligações fosfodiester (PO4-) entre nucleótidos. Estas, dependendo de onde façam o corte, podem ser divididas em endonucleases ( corte interno) e exonucleases (corte externo).

Das endonucleases, as mais conhecidas são as enzimas de restrição. Estas enzimas são proveninentes do sistema de defesa de bactérias e são utilizadas a quando a infecção das mesmas por DNA estranho de um bacteriofago (clivando-o).

As enzimas de restrição reconhecem e ligam-se a sequências específicas de enzima para enzima! Isto, é de extrema importância e permitide dividir estas enzimas em dois tipos:

• Tipo I e III: Fazem cortes pouco rigorosos. Por norma, o corte acontece um pouco à frente ou atrás do local de ligação.
• Tipo II: Fazem cortes bastantes específicos, normalmente, no local onde ocorre a ligação da enzima. Isto torna-as vantajosas, uma vez que permite prever o corte das mesmas.

Para além disto, as enzimas de restrição podem formar dois tipos de cortes nas sequências terminais:

• Blunt-ends: os chamados fins lisos! Isto é, logo após o corte da molécula de DNA em dois fragmentos pela enzima de restrição (quebra de ligações fosfodiester) e, uma vez que os dois fragmentos não apresenta complementaridade de bases entre si, em solução estes vão ficar fisicamente separados entre si.

• Sticky-ends (fins coesivos): a enzima ao fazer o corte cria "overhangs" (fins protuberantes) dando a capacidade aos dois fragmentos que criem complementaridade de bases (por pontes de H.) entre si. Isto, permite que mesmo com as ligações fosfodiester quebradas, consigam ficar fisicamente próximas num tubo de ensaio.

Apesar de cada enzima de restrição ter uma sequência própria de ligação de enzima para enzima, podem ser criados os mesmos fins protuberantes a partir de enzimas diferentes. Para além desta característica importante, devemos salvaguardar a actividade “polindrómica” destas enzimas. Isto é, independentemente da orientação da cadeia de DNA (5’-3’ ou 3’-5’) o corte será feito sempre na mesma zona (sequência de nucleótidos específica).

Podem procurar mais informação em: T.A. Brown: Genomes 3, Garland Science.

DNA’s Polimerases

Enzimas que formam fragmentos de DNA a partir de um molde pré-existente, por complementaridade de bases.

Estas, dependem dos primers (iniciadores moleculares) : oligonucléotidos de 20 nucleótidos de cadeia dupla, ao qual a enzima polimerase se liga para começar a sintetizar a nova molécula.

[Desenhar Primer]: Como o primer se liga, por complementaridade de bases à molécula de DNA imediatamente logo ao local a copiar, podemos elaborar um primer (conjugando os pares de bases) para que este se ligue a uma sequência específica, imediatamente antes da sequência de interesse.

As polimerases só constroem do 5'-3', respeitanto sempre o antiparalelismo característico da molécula de DNA.

Podemos dividir as Polimerases em dois tipos: as que não tem a capacidade de corrigir erros de montagem e as que possuem actividade exonucleásica:

· As primeiras, Polimerase 5'-3': só tem a capacidade de sintetizar a molécula, não podendo assim corrigir algum erro associado ao processo;

· As que possuem actividade exonucleásica podem ser divididas em dois tipos:

• 3'-5' actividade exonucleásica: montam do mesmo lado que desmontam (proofreading). Isto é, montam e verificam (avançam ou reparam)! Sempre que ocorre um erro é eliminado nucleótido a nucleótido.
• 5'-3' actividade exonucleásica: a correcção ocorre no lado oposto à montagem! Isto é, a enzima primeiro monta e depois retorna ao inicio para corrigir possíveis erros! O erro leva ao corte de uma sequência de nucleótidos.

A última actividade exonucleástica não tem interesse na engenharia genética e nas técnicas de DNA recombinante, uma vez que a cadeias nucleótidica criada seria prontemente degradada pela acção da enzima.

Alguns exemplos de Polimerases:

Polimerase I (E. Coli): apresenta as actividades exonucleásica 3'-5' e 5'-3'! Não é de grande utilidade para as técnicas de engenharia genética (devido à ultima actividade exonucleásica).

Klenow Polimerase: A enzima apresenta a subunidade que lhe confere a actividade exonucleásica 5-3 clivada, desactivando esta função. Como tal, torna-se perfeitamente aplicável as técnincas de eng. Genética.

Sequenase: utilizadas na técnica de sequênciação de DNA;

Taq Polimerase: proveninentes do Thermophilus Aquaticus, um extremófilo, apresenta uma enorme capacidade de resistência a temperaturas de desnaturação! É utilizada no PCR, por preservar a sua funcionalidade mesmo em altas temperaturas.

Podem procurar mais informação em: T.A. Brown: Genomes 3, Garland Science.