"Sistema Nervoso" nas Plantas

Apesar das plantas não possuírem um sistema nervoso extremamente desenvolvido e organizado em diferentes tecidos e em sistemas, como no animais, estas tem apresentam a células nervosas: com a capacidade de inverter o potencial de membrana e produzir um potencial de acção. Este mesmo potencial de acção é extremamente importante, em organismos como a Mimosa pudica, de modo a produzirem-se respostas fisiológicas (como os movimentos násticos ou mesmo diversos trofismos).


O conceito de sistema nervoso em plantas, foi começado a ser trabalho por Burdon Sanderson (1873) e Charles Darwin (1875): descobriu potenciais de acção em folhas de Dionaea (“planta carnívora”). Com a utilização de eléctrodos em feixes condutores da planta, descobriram uma corrente eléctrica (causada pelas diferenças de potenciais eléctricos). Por sua vez, Sibaoka (1996) e Pickard (1973) afirmaram que os potenciais de acção (a tal corrente eléctrica já registada por Darwin) seriam utilizados em respostas fisiológicas. Para além disto, afirmou que os mesmos estímulos nervosos seriam de certa forma homólogos aqueles que ocorrem nas células nervosas dos animais. Foi já com Schroeder, Hedrich & Ferandez  (1984) que foi possível concluir que a formação desta "corrente eléctrica" (potenciais de acção) seriam responsáveis por montar e regular determinadas respostas fisiológicas desta a um dado estímulo do meio ambiente.


Mas afinal de contas, qual a importância de um sistema nervoso em plantas? A resposta surge de forma óbvia: para montarmos respostas fisiológicos extremamente rápidas que permitam compensar a falta de mobilidade da planta face ao meio ambiente (plasticidade metabólica). Um dado estímulo do meio-ambiente vai provocar a despncentração de uma dada hormona) será montada, resultando numa resposta fisiológica extremamente coordenada por parte de todo o organismo vegetal olarização (inversão da condutância iónica por parte de canais iónicos específicos) e assim formar um  potencial de acção que irá levar a informação do tal estímulo, a toda a planta. Após isto, a resposta efectora (por exemplo, o aumento da co- o potencial de acção funciona apenas como um "simples" e rápido mensageiro, sem apresentar a capacidade de por si só, resolver o "problema".


Este sistema nervoso das plantas, apresenta características extremamente semelhantes àquelas encontradas em animais, como algumas perfeitamente antagónicas. Apresentam um potencial limiar (responsável pela chamada lei do tudo ou nada), uma amplificação do sinal nervoso ao longo do organismo por processos vegetais (que não envolvem consumo de ATP) e a capacidade de uma comunicação célula-a-célula extremamente rápida, tal como nos animais. Por outro lado, as plantas apresentam um período refractário bastante mais longo que estes e os canais iónicos envolvidos não são os de Sódio e Potássio, mas os de Cálcio, Cloro e Potássio.


A comunicação nervosa, a nível "local", utiliza a via simplástica e a utilização dos plasmodesmos (integração metabólica) da mesma. Quando a resposta se quer mais generalizada, são utilizados os elementos crivosos dos vasos floémicos como meios de comunicação. De referir também que, nas células "sensores" (que recebem o estímulo) o estímulo para além de apresentar a necessidade de se apresentar com intensidade suficiente para ultrapassar o potencial limiar, deve ser duplicado (apenas possível num estímulo contínuo), o que permite a montagem de uma resposta fisiológica em situações de real importância.


No floema, os potencias de acção passam de elemento para elemento crivoso, utilizando transportadores iónicos específicos. Para além disto, é de extrema importância que os fotoassimilados apresentem pouca resistência a este impulso eléctrico. O facto mais interessante é que homologamente às bainhas de mielina nos neurónios animais, as células vegetais apresentam esclerênquima que restringe a passagem da informação nervosa das células de companhia para o floema (sendo feita apenas em "pontos" específicos).


Por fim, é importante referir que todo o processo é dependente da existência de canais iónicos nas células vegetais. Sendo esta capacidade de alterar a condutância iónica a determinados iões que permite produzir os tão importantes potenciais de acção. De referir também que a importância de grande quantidades citoplasmáticas de cálcio que irá obrigar este impulso a percorrer a via simplástica (devida à libertação destes pelos plasmodemos, utilizados na integração metabólica entre células distintas).

Potencial osmótico da Água

Podemos definir o potencial químico da água como a energia livre de um mol de água capaz de realizar trabalho, isto é, a medida de energia livre produzida por unidade de volume. Esta é influenciada pelos potenciais: osmótico, pressão e de gravidade.

• Potencial osmótico:

Este potencial representa o efeito de determinada concentração de solutos dissolvidos numa dada quantidade de água.

Podemos deduzir que o aumento da concentração de solutos diminui o potencial osmótico da água, uma vez que: os solutos reduzem a energia livre da água através da sua diluição. Como este potencial se relaciona directamente com o potencial químico da água, podemos afirmar que o aumento de solutos diminui o potencial osmótico químico da água.

• Potencial de pressão:

O potencial de pressão, representa o efeito da pressão a qual o sistema está sujeito e o valor pode ser negativo ou positivo:

Pressão positiva faz aumentar o potencial de pressão;

Pressão negativa faz diminuir o potencial de pressão e é denominada por tensão.

O movimento da água ocorre sempre de locais com pressão positiva para locais com pressão negativa (do maior potencial para o menor), isto é, a pressão tende sempre a compensar a tensão. Esta é a “regra” que faz a água circular pelo interior dos tubos xilémicos desde a raiz da planta (pressão positiva, pela entrada de água) até às folhas das mesmas (onde ocorre a chamada, tensão superficial causada pela transpiração foliar).

• Potencial de gravidade:

Reflecte o efeito da gravidade a que uma determinada solução está sujeita. Este potencial só tem real influência em árvores de grande porte. Como tal, a nível celular é desprezado para as considerações do potencial químico da água.

No solo, o principal componente da entrada da água na raiz é o potencial de pressão (o potencial do soluto só tem real influência em solos salinos). Este, será decrescente ao longo da planta, de modo a que o movimento da água seja ascendente (lembrar que, a água movimentasse sempre do maior potencial de pressão para o menor). Apenas respeitando estas considerações termodinâmica é que a planta consegue transportar eficazmente água sem consumir energia e sem um sistema de propulsão próprio.

Transporte de Água

O transporte de água é um transporte passivo, isto é, respeitando as leis da termodinâmica leva a que seja levada sempre para regiões de menor energia livre (para não termos de adicionar energia externa ao sistema biológico). Isto é, podemos dizer que os fluxos de água ocorrem sempre de zonas com maior energia potencial, para zonas onde essa mesma energia potencial é menor (processo espontâneo);

Podemos dividir o transporte em três diferentes tipos: diusão, fluxo em massa e osmose.

• Difusão:

Ocorre um movimento aleatório (Browniano) das moléculas de água , respeitando sempre um gradiente de concentração: da maior concentração de soluto, para a menor concentração. Isto é, há a tentativa do sistema, de forma passiva (sem consumo de ATP) , a atingir o equilíbrio químico no que toca à concentração do soluto em questão.

Podemos definir então que, a taxa de difusão é proporcional à diferença de concentração para um determinado soluto. Como tal, este será um mecanismo extremamente importante a pequenas distâncias, mas algo lento a distâncias longas.

• Fluxo em massa:

Ocorre o movimento de água mediante um gradiente de pressão, não existindo assim, o fornecimento de energia ao sistema, para que este movimento ocorra. Este é o principal mecanismo do transporte de  pelos vasos xilémicos da planta e, pelo qual, água vai desde as raízes (absorvida no solo) até aos diferentes tecidos vegetais.

• Osmose:

Este mecanismo, implica o movimento de água através de uma membrana, recorrendo aos gradientes de concentração e de pressão.

Em tecidos vegetais, este processo ocorre essencialmente com o auxílio das aquapurinas (conjunto de proteínas intrínsecas que funciona como um canal selectivo de moléculas de água).

Água: "Recurso chave" das células vegetais

A água é o principal constituinte das células vegetais. Ela é responsável por muitas reacções que nela ocorrem uma vez que se comporta como meio de reacção e como um excelente solvente, proporcionando assim o ambiente necessário para a movimentação das várias moléculas no interior das células. Para além disto, a água tem um papel importantíssimo em vários processos fisiológicos e estruturais como o crescimento e no alargamento celular, nas trocas gasosas nas folhas, em vários processos de transporte e até na estabilidade mecânica de tecidos não lenhificados (turgência das células vegetais).

Como tal, é necessário que os organismos vegetais (que ao contrário dos animais, não tem um sistema cardiovascular) façam chegar água a todas as partes do seu organismo com o consumo mínimo de energia. O que à primeira vista parece ser um complexo problema de termodinâmica revelasse uma manobra inteligentíssima que explora as características físico-químicas da água.

A água, é constituída por um átomo de Oxigénio e dois de Hidrogénio, por ligações covalentes formando uma molécula com a forma de um tetraedro (ângulo de 104,5˚ devido aos electrões não-ligantes do oxigénio). O átomo de Oxigénio é muito mais electronegativo do que os dois átomos de hidrogénio o que dá uma das características mais importantes desta molécula: assimetria eléctrica, ou seja, dipolo eléctrico.  Esta característica é responsável por:

• Atracções electrostáticas entre diferentes moléculas de água;
• Formação de pontes de hidrogénio;
• Bom solvente de grupos iónicos e de solventes polares: redução das repulsões electrostáticas das cargas das mesmas, aumentando assim a sua solubilidade (neutralização das cargas iónicas e das moléculas polares);
• Propriedades térmicas essências à vida;

PCR

Com avanço da tecnologia, novas técnicas de copiar o DNA foram surgindo, assim, em poucas horas e in vitro utilizando a técnica de PCR ( polimerase chain reaction ) é possível sinterizar grandes quantidades de um fragmento de DNA. Não se trata de um técnica substituta da clonagem, trata-se pois de um técnica ‘’complementar’’. Não consegue substituir a clonagem, uma vez que é dependente de um ‘’molde’’ previamente conhecido.
Posto isto, desta técnica resulta múltiplas cópias de uma região de interesse num fragemento de DNA. Trata-se duma técnica que não requer células vivas, uma vez que é realizada in vitro e apenas requer: Molde de DNA, primer, DNA polimerase ( Taq polimerase)e nucleótidos livres.
Uma das dificuldades nesta técnica seria arranjar uma polimerase que não desnaturasse à temperatura de desnaturação do DNA e por isso utiliza-se a Taq polimerase, uma polimerase extraída de T.aquaticus, um extremófilo.
E como ocorre a reacção?
1) Aumenta-se a temperatura da mistura (Molde de DNA, primer, DNA polimerase ( Taq polimerase)e nucleótidos livres) , no tubo de ensaio, até aos 94ºC: a esta temperatura, as pontes de hidrogénio que unem as duas cadeias de DNA, pelas bases azotadas são quebradas, originando duas moléculas de DNA em cadeia simples.
2) Baixa-se a temperatura até aos 50-60ºC: isto, vai permitir que os primers se liguem ao segmento (numa dada sequencia) a copiar.
3) Aumenta-se novamente a temperatura, desta vez, até aos 72ºC (T óptima da Taq polimerase: inicia-se a síntese do DNA) : Nesta primeira fase há a produção de ‘’produtos longos’’ a partir da cadeia de DNA .
[Oligonucliótidos cadeia simples longos ( produtos longos) : apresentam extremidades 5’ idênticas, mas extremidades 3’ aleatórias, isto é, a aleatoriedade das extremidades 3’ devem-se aos locais de fim de síntese de DNA, isto é, onde a reacção de polimerização pára! ]
4) Após o fim de um ciclo de desnaturação - anneling (renaturação)-sintese, os ‘’produtos longos’’ irão funcionar como moldes para mais um ciclo de PCR, originando ‘’Produtos pequenos’’.
[Podutos pequenos: As extremidades 5’ e 3’ são ditadas pelo local de ligação do primer, isto é, oligonucleótidos iguais e com fins iguais.
Ao longo de vários ciclos, o numero de ‘’produtos pequenos’’ que são cadeia de interesse, aumenta de forma exponencial.
Para que possamos verificar a eficiência do PCR recorremos à técnica de electroforese, ou seja, como o que se pretende é amplificar (copiar) um segmento específico de DNA, caso o PCR tenha sido bem feito, o resultado da electroforese será uma marca ‘’carregada’’ visível no gel de electroforese (agarose ou policrilamida), sendo que, todas as moléculas de DNA apresentam o mesmo tamanho. Por outro lado, caso o PCR não tenha sido eficiente será visível, no gel, uma sequência de bandas ( bandas de ‘’smear’’) .

Vector Shuttle: o plasmídeo integrativo

Se quisermos obter uma determinada proteína a partir da molécula de DNA a clonar, tornasse necessário utilizar outros organismos para além da E. coli. Isto, levanta no entanto problemas, uma vez que, as técnicas de recombinação em organismo como leveduras são, usualmente, mais complicadas comparativamente ao uso em bactérias. Para resolvermos esta questão, surge oplasmídeo integrativo: plasmídeo que é recombinado num organismo e transformado num outro.

A presença do gene ori da E. coli, possibilita a construção do plasmídeo recombinante antes de ser transferido para as células de leveduras. Isto é, os genes são clonados nas bactérias (pela acção da mesma enzima de restrição, adicionamos o fragmento de DNA de interesse ao vector) e transformados em leveduras. Esta integração é conseguida pelo gene URA3 através de umarecombinação homóloga.

Para facilitar a transformação, as leveduras são utilizadas como protoplasto. Isto é, são cultivadas em meio de cultura sem a sua parede celular. Para além disto, apresentam o gene URA3 mutado ( ), para ser possível separar as leveduras clonadas das não clonadas.

Este vector integrativo apresenta:

• Gene URA3: este gene possibilita a recombinação homóloga entre o vector da bactéria e um cromossoma da levedura. No momento da recombinação homóloga, o cromossoma da levedura (ao alojar o plasmídeo recombinante) ficará com um locus para o URA3 funcional e outro mutado. As leveduras com o DNA recombinante ( /URA3 e URA3/URA3) são assim separadas das leveduras onde não ocorreu recombinação homóloga ( / ), fazendo-as crescer em meio mínimo em uracilo (só as leveduras recombinantes vão conseguir dividir-se e crescer).
• Gene que confere resistência à ampicilina e à tetraciclina: utilizados como marcas de selecção. Isto, permite diferenciar as bactérias que apresentam o vector plasmideal das que apresentam os plasmídeos normais, fazendo crescer as bactérias em meio rico em ampicilina e tetraciclina.
• Ori: permite que o gene seja replicado como DNA plasmideal na bactéria. Isto, vai permitir que a partir das sucessivas divisões de bactérias seja possível obtermos grandes quantidades do vector e, apartir disto, purifica-los para posteriormente transformá-los em bactérias.

YAC’s ( Cromossomas Artificiais de Leveduras):

São cromossomas obtidos “artificialmente” a partir de plasmideos que se propagam em leveduras (como a S. cerevisiae) e representam a primeira tentativa para introduzir moléculas de DNA acima dos 50 pares de bases. Porém, estão associados a um enorme problema de estabilidade e a possibilidade de sofrerem rearranjos, originando novas combinações.

Um cromossoma é caracterizado por:

• Telómeros: sequências específicas que ditam o fim da molécula de DNA.
• Centrómeros: importantes na divisão celular.
• Origem de Replicação: ditam o inicio da replicação da molécula de DNA a cada divisão do cromossoma.

O YAC, apresenta:

• Local de ligação para enzima de restrição BamHI: como existe um local de ligação para esta enzima de restrição, após o corte na molécula circular, terá origem uma molécula de DNA linear.
• Gene URA3 e TRP: são genes presentes na biossíntese de compostos (Uracilo e Triptofano). Isto, irá funcionar como uma marca de selecção para separarmos as leveduras com os vectores das que não apresentam o vector. Isto é, ao fazermos as leveduras crescerem em meio mínimo de uracilo e triptofano e, uma vez que as leveduras sem o vector não apresentam os genes URA3 e TRP funcional, apenas irão crescer no nosso meio de cultura bactérias que contenham o vector (recombinante ou não).
• Gene SUP4 com local de ligação para a enzima de restrição: este gene será a marca de selecção para separar os vectores que contem os fragmentos de restrição dos restantes. Isto é, se cortarmos uma determinada molécula de DNA de interesse com a mesma enzima de restrição para qual o SUP4 possuí um local de ligação, estaremos a promover uma inibição por excerto. Isto é, com a inserção da sequência de interesse, o gene SUP4 irá perder a sua funcionalidade, sendo possível então por métodos colorimétricos diferenciar dos que tem o gene SUP4 activo (sem o fragmento de restrição).
• Ori: origem de replicação para que o cromossoma artificial tenha a capacidade de ser replicar a cada divisão da levedura.
• CEN4: origina o centrómero essencial para a correcta constituição do cromossoma.
• TEL: origina os telómeros que farão parte do cromossoma artificial.