- Potencial osmótico:
- Potencial de pressão:
- Potencial de gravidade:
Se quisermos obter uma determinada proteína a partir da molécula de DNA a clonar, tornasse necessário utilizar outros organismos para além da E. coli. Isto, levanta no entanto problemas, uma vez que, as técnicas de recombinação em organismo como leveduras são, usualmente, mais complicadas comparativamente ao uso em bactérias. Para resolvermos esta questão, surge oplasmídeo integrativo: plasmídeo que é recombinado num organismo e transformado num outro.
A presença do gene ori da E. coli, possibilita a construção do plasmídeo recombinante antes de ser transferido para as células de leveduras. Isto é, os genes são clonados nas bactérias (pela acção da mesma enzima de restrição, adicionamos o fragmento de DNA de interesse ao vector) e transformados em leveduras. Esta integração é conseguida pelo gene URA3 através de umarecombinação homóloga.
Para facilitar a transformação, as leveduras são utilizadas como protoplasto. Isto é, são cultivadas em meio de cultura sem a sua parede celular. Para além disto, apresentam o gene URA3 mutado (
Este vector integrativo apresenta:
São cromossomas obtidos “artificialmente” a partir de plasmideos que se propagam em leveduras (como a S. cerevisiae) e representam a primeira tentativa para introduzir moléculas de DNA acima dos 50 pares de bases. Porém, estão associados a um enorme problema de estabilidade e a possibilidade de sofrerem rearranjos, originando novas combinações.
Um cromossoma é caracterizado por:
O YAC, apresenta:
No ponto de vista da Eng. Genética, seria muito mais vantajoso se fosse possível direccionar o ciclo de vida para uma fase lítica, de forma a obter o máximo de fagos (com o DNA recombinante) no menor tempo possível. Isto é possível através da eliminação do gene que confere a incorporação do DNA do fago no genoma da bactéria, na sequência que representa o genoma do Bacteriófago λ. Esta técnica, para além de “direccionar” o ciclo de vida, torna possível a inserção de uma maior molécula de DNA (comparativamente aos vectores de plasmídeos).
O genoma de λ para além de ser uma molécula linear, apresenta fins coesivos (cos sites), característica “diagnóstica” do DNA viral. Como estas pontas apresentam propriedades coesivas, dependendo da forma como se liguem, podem originar: concatámeros (molécula de DNA linear) e os cósmidos (molécula de DNA circular).
Formação de concatámeros:
Como referido anteriormente, a molécula de DNA λ possuí a forma linear e, quando tratada com uma determinada enzima de restrição, será clivada originando “Left cos site” e um “Right cos site”. Por sua vez, se fizermos um corte na molécula que queremos recombinar, utilizando a mesma enzima de restrição e pela acção das ligases é possível formar: Left cos site – DNA interesse – Right cos site. Por sua vez, como cada sequência apresenta fins coesivos entre si, é possível originar um fragmento de DNA em que o gene que pretendemos clonar, surge de sob a forma de cópias múltiplas e sequencial, intercalado com os diferentes “cos site”:
Left cos site- DNA – Right Cos site – Left cos site – Right cos site – DNA – Left cos site
A propriedade “cos site” é de extrema importância na utilização do vector de bacteriófago, uma vez que, promove a formação espontânea de fagos in vitro a partir de proteínas que constitutem a cápsula (empacotamento in vitro.).
A quando do empacotamento in vitro ocorre uma clivagem do fragmento de DNA λ , de modo a que: todas as sequências de DNA que eles empacotem sejam recombinada (Left cos site – DNA – Right cos site) uma vez que a sequência Left cos site – Right cos site é pequena de mais para sofrer o empactomento. É então possível definir que um fragmento de DNA só pode ser empacotado in vitro se: conter em cada terminal um cos site e for composto por 37 a 52 pares de base.
Após a transfecção dos vírus para o interior das bactérias, devemos proceder ao plaqueamento da suspensão (bactérias + vírus) para uma placa de petri, formando assim uma camada homogénea de bactérias. Neste ponto, devemos ter em consideração que:
Formação de cósmidos:
O cósmido é uma molécula de DNA circular que é obtida a partir do genoma de λ. Isto é, os cos sites em vez de se complementarem com outros fins coesivos, após a recombinação com um fragmento de DNA de interesse (utilizando a mesma enzima de restrição em ambos os cortes) vão ligar-se entre si, formando uma molécula de DNA circular contendo o gene de interesse e um locus cos site.
Esta, como apresenta cos site pudera sofrer o empacotamento in vitro originando fagos λ contendo a moléucula de DNA circular “recombinada”. Porém, como esta molécula é de grandes dimensões não será tida em conta como um fragmento de DNA viral, sendo no entanto, mantida no citoplasma como DNA plasmideal.
De salvaguardar que, este plasmídeo é diferente do vector plasmídeal utilizado em bactérias, uma vez que apresenta a possibilidade de inserção de um fragmento de maiores dimensões comparativamente a um vector bacteriano.
Situação 1: Injectou bactérias do tipo S num rato. O rato morre de pneumonia.
Situação 2: Injectou bactérias do tipo R num rato. O rato sobrevive, pois o seu sistema imunitário assegura a destruição deste tipo de bactéria.
Situação 3: Injectou bactérias do tipo S, mortas pelo calor, num rato. O rato sobrevive, pois o agente infeccioso encontra-se morto.
Situação 4: Injectou uma mistura de bactérias do tipo S mortas pelo calor e bactérias do tipo R vivas, num rato. O rato morre. Ao analisar o sangue do rato encontra bactérias do tipo R e do tipo S.
Assim, a hipótese que levantou, é que existiria algo que permitia às bactérias do tipo R adquirir a características patogénicas provenientes das bactérias do tipo S.
Passados uns anos, em 1945, Oswald Avery, intrigado sobre o que seria o tal ‘’principio transformante’’, cultivou células do tipo S e posteriormente matou-as com calor e provocou a lise celular, tendo em seguida separado componentes como glícidos, lípidos, proteínas e DNA. Pegou em cada um destes componentes juntamente com bactérias do tipo R e injectou num rato. O que verificou foi que apenas a mistura de DNA ( das bactérias do tipo S) + Bactérias do tipo R provocava pneumonia no rato, e que portanto, apenas esta mistura transformava bactérias do tipo R em bactérias do tipo S. Assim, para vincar a sua descoberta adicionou à mistura referida desoxirribonuclease (destrói o DNA), e verificou que nada acontecia, isto é, as bactérias do tipo R não se transformavam em bactérias patogénicas.
Conclui assim, que o DNA seria o ‘’principio transformante’’.
Em, 1952, Alfred Hershey e Martha Chase, realizaram experiencias com bacteriófagos ( vírus que infectam bactérias) . O vírus é apenas constituído por proteínas e ácido nucleico e apenas por duas partes: A cabeça e a cauda. A cápsula do vírus possui proteínas ricas em enxofre e o ADN existente no seu interior é rico em fósforo. A infecção por parte do virús dá-se quando este se agarra à bactéria com a cauda e injecta no seu interior algo que irá controlar, apartir do citoplasma bacteriano, a formação de mais vírus.
Nesta experiencia, para saberem o quê que entrava para dentro da bactéria e que controlaria a formação de novos vírus, utilizaram enxofre radioactivo (35S) e fósforo radioactivo (32P ) .Realizaram então duas experiencias:
Experiencia 1:Cultivaram bacteriófagos em meio que continha enxofre radioactivo, que posto isto ficaram com as proteínas radioactivas. Posteriormente estes vírus infectaram bactérias não radioactivas. Observaram então, que a radioactividade permanecia no exterior das bactérias.
Experiencia 2: Cultivaram bacteriófagos em meio que continha fósforo radioactivo, que posto isto ficaram com os ácidos nucleicos radioactivos. Posteriormente estes vírus infectaram bactérias não radioactivas. Observaram então, que a radioactividade se encontrava no interior das bactérias.
Concluíram assim que, sendo o DNA viral que entra para o interior da bactérias, então seria ele que teria informação para comandar o fabrico de novos vírus.
Agora que já se sabia qual a molécula responsável pela transmissão da informação genética, pretendia-se saber como seria a estrutura dela, e de que forma ela funcionaria.
Assim, em 1953, JamesWatson e Francis Crick propuseram o que é actualmente conhecida como a estrutura da molécula de DNA. Baseados em imagens de difracção de Raio-x obtidas por Rosalind Frankin e nas conclusões de Erwin Chargaff acerca da relação entre as bases azotadas ( T+C = A+G), propuseram o modelo de dupla hélice do DNA. Este modelo sugeria que:
- O DNA possui duas cadeias helicoidais sim que se enrolam num mesmo eixo formando uma dupla hélice.
- o esqueleto hidrofílico ( desoxirribose e grupos fosfato carregados negativamente) encontra-se na parte externa da dupla hélice, voltados para a agua circundante.
- o esqueleto hidrofóbico ( a bases purinas e pirimidicas) está voltado para dentro da dupla hélice.
- o emparelhamento das duas cadeias cria um sulco maior e um sulco menor na superfície da dupla hélice.
- cada uma das cadeias está emparelhada com a outra cadeia, unidas por pontes de hidrogénio entre as bases azotadas ( Citosina e Guanina formam três pontes de hidrogénio e Timina e Adenina formam duas pontes de hidrogénio).
- as cadeias de DNA da estrutura em dupla hélice são antiparalelas, isto é, à extremidade 5’ de uma das cadeias corresponde a extremidade 3’ da outra cadeia.
De uma forma generalista, podemos designar por clonagem a inserção de uma molécula de DNA de um organismo noutro organismo diferente. Como tal, surge a necessidade de definirmos o que se trata de DNA recombinante.
O DNA recombinante resulta da habilidade de controlar técnicas de biologia molécular (cortes por enzimas de restrição e ligases) de modo a criar uma molécula de DNA “manipulada”. Podemos definir o DNA recombinante como uma molécula de DNA resultante de duas completamente distintas.
Uma sequência de um gene animal, por exemplo, e um plasmídeo são tratados com a mesma enzima de restrição. Isto, vai resultar na formação de fins coesivos “complementares” entre as diferentes moléculas de DNA. De seguida, pela acção de ligases é possível criar ligações fosfodiester estáveis entre os dois genes e criar assim uma única molécula de DNA (a partir dos dois fragmentos).
De seguida, esta molécula de DNA recombinada e circular pode ser transferida (transformada) para o interior de um organismo (uma bactéria, por exemplo) de modo a ser replicada e aumentar o seu número. Se, plaquearmos esse mesmo microorganismo, irão originar-se colónias (por divisões a partir de um único organismo) na qual poderemos obter grandes quantidades do gene recombinado.
As DNA’s ligases são enzimas que apresentam a capacidade de formar ligações fosfodiester estáveis entre diferentes nucléotidos (entre o Carbono 5 de um e o C3 do seguinte), com o consumo de ATP (ou outro composto com três fosfatos como: GTP,CTP e TTP), tornando a reacção termodinâmicamente favorável. De salvaguardar que, por razões de estabilidade, a acção desta enzima é favorecida quando o substrato é composto por duplas cadeias de DNA.
Estas enzimas, tem a capacidade de funcionar numa única molécula de DNA e ligar as duas extremidades da mesma, formando uma molécula de DNA circular. Por outro lado, tem a capacidade de ligar dois fragmentos distintos de DNA (sendo muito utilizado para a formação de DNA recombinante).
A aplicação desta enzima é copulada à acção das enzimas de restrição (“copy past” molecular), uma vez que as DNA ligases tem a capacidade de ligar dois cortes produzidos pela mesma enzima de restrição. Contudo, uma vez que as DNA’s ligases não apresentam a capacidade de “carregar” os fragmentos de DNA e manter-los em posições favoráveis para criar as ligações fosfodiester entre os diferentes nucleótidos, a sua acção tenderá a ocorrer mais facilmente fragmentos de DNA coesivos (por estarem fisicamente próximos por complementaridade de bases “transitórias”) do que em fins lisos (“blunt-ends”).
Como nem sempre é possível obtermos fragmentos de DNA com fins coesivos (pela acção de uma enzima de restrição), tiveram de ser criadas formas de, indirectamente, converter os fins lisos a fins coesivos: Modificadores terminais.
Podem procurar mais informação em: T.A. Brown: Genomes 3, Garland Science.
As nucleases são enzimas conhecidas por degradas ligações fosfodiester (PO4-) entre nucleótidos. Estas, dependendo de onde façam o corte, podem ser divididas em endonucleases ( corte interno) e exonucleases (corte externo).
Das endonucleases, as mais conhecidas são as enzimas de restrição. Estas enzimas são proveninentes do sistema de defesa de bactérias e são utilizadas a quando a infecção das mesmas por DNA estranho de um bacteriofago (clivando-o).
As enzimas de restrição reconhecem e ligam-se a sequências específicas de enzima para enzima! Isto, é de extrema importância e permitide dividir estas enzimas em dois tipos:
Para além disto, as enzimas de restrição podem formar dois tipos de cortes nas sequências terminais:
Apesar de cada enzima de restrição ter uma sequência própria de ligação de enzima para enzima, podem ser criados os mesmos fins protuberantes a partir de enzimas diferentes. Para além desta característica importante, devemos salvaguardar a actividade “polindrómica” destas enzimas. Isto é, independentemente da orientação da cadeia de DNA (5’-3’ ou 3’-5’) o corte será feito sempre na mesma zona (sequência de nucleótidos específica).
Podem procurar mais informação em: T.A. Brown: Genomes 3, Garland Science.
Enzimas que formam fragmentos de DNA a partir de um molde pré-existente, por complementaridade de bases.
Estas, dependem dos primers (iniciadores moleculares) : oligonucléotidos de 20 nucleótidos de cadeia dupla, ao qual a enzima polimerase se liga para começar a sintetizar a nova molécula.
[Desenhar Primer]: Como o primer se liga, por complementaridade de bases à molécula de DNA imediatamente logo ao local a copiar, podemos elaborar um primer (conjugando os pares de bases) para que este se ligue a uma sequência específica, imediatamente antes da sequência de interesse.
As polimerases só constroem do 5'-3', respeitanto sempre o antiparalelismo característico da molécula de DNA.
Podemos dividir as Polimerases em dois tipos: as que não tem a capacidade de corrigir erros de montagem e as que possuem actividade exonucleásica:
· As primeiras, Polimerase 5'-3': só tem a capacidade de sintetizar a molécula, não podendo assim corrigir algum erro associado ao processo;
· As que possuem actividade exonucleásica podem ser divididas em dois tipos:
A última actividade exonucleástica não tem interesse na engenharia genética e nas técnicas de DNA recombinante, uma vez que a cadeias nucleótidica criada seria prontemente degradada pela acção da enzima.
Alguns exemplos de Polimerases:
Polimerase I (E. Coli): apresenta as actividades exonucleásica 3'-5' e 5'-3'! Não é de grande utilidade para as técnicas de engenharia genética (devido à ultima actividade exonucleásica).
Klenow Polimerase: A enzima apresenta a subunidade que lhe confere a actividade exonucleásica 5-3 clivada, desactivando esta função. Como tal, torna-se perfeitamente aplicável as técnincas de eng. Genética.
Sequenase: utilizadas na técnica de sequênciação de DNA;
Taq Polimerase: proveninentes do Thermophilus Aquaticus, um extremófilo, apresenta uma enorme capacidade de resistência a temperaturas de desnaturação! É utilizada no PCR, por preservar a sua funcionalidade mesmo em altas temperaturas.
Podem procurar mais informação em: T.A. Brown: Genomes 3, Garland Science.