PCR

Com avanço da tecnologia, novas técnicas de copiar o DNA foram surgindo, assim, em poucas horas e in vitro utilizando a técnica de PCR ( polimerase chain reaction ) é possível sinterizar grandes quantidades de um fragmento de DNA. Não se trata de um técnica substituta da clonagem, trata-se pois de um técnica ‘’complementar’’. Não consegue substituir a clonagem, uma vez que é dependente de um ‘’molde’’ previamente conhecido.
Posto isto, desta técnica resulta múltiplas cópias de uma região de interesse num fragemento de DNA. Trata-se duma técnica que não requer células vivas, uma vez que é realizada in vitro e apenas requer: Molde de DNA, primer, DNA polimerase ( Taq polimerase)e nucleótidos livres.
Uma das dificuldades nesta técnica seria arranjar uma polimerase que não desnaturasse à temperatura de desnaturação do DNA e por isso utiliza-se a Taq polimerase, uma polimerase extraída de T.aquaticus, um extremófilo.
E como ocorre a reacção?
1) Aumenta-se a temperatura da mistura (Molde de DNA, primer, DNA polimerase ( Taq polimerase)e nucleótidos livres) , no tubo de ensaio, até aos 94ºC: a esta temperatura, as pontes de hidrogénio que unem as duas cadeias de DNA, pelas bases azotadas são quebradas, originando duas moléculas de DNA em cadeia simples.
2) Baixa-se a temperatura até aos 50-60ºC: isto, vai permitir que os primers se liguem ao segmento (numa dada sequencia) a copiar.
3) Aumenta-se novamente a temperatura, desta vez, até aos 72ºC (T óptima da Taq polimerase: inicia-se a síntese do DNA) : Nesta primeira fase há a produção de ‘’produtos longos’’ a partir da cadeia de DNA .
[Oligonucliótidos cadeia simples longos ( produtos longos) : apresentam extremidades 5’ idênticas, mas extremidades 3’ aleatórias, isto é, a aleatoriedade das extremidades 3’ devem-se aos locais de fim de síntese de DNA, isto é, onde a reacção de polimerização pára! ]
4) Após o fim de um ciclo de desnaturação - anneling (renaturação)-sintese, os ‘’produtos longos’’ irão funcionar como moldes para mais um ciclo de PCR, originando ‘’Produtos pequenos’’.
[Podutos pequenos: As extremidades 5’ e 3’ são ditadas pelo local de ligação do primer, isto é, oligonucleótidos iguais e com fins iguais.
Ao longo de vários ciclos, o numero de ‘’produtos pequenos’’ que são cadeia de interesse, aumenta de forma exponencial.
Para que possamos verificar a eficiência do PCR recorremos à técnica de electroforese, ou seja, como o que se pretende é amplificar (copiar) um segmento específico de DNA, caso o PCR tenha sido bem feito, o resultado da electroforese será uma marca ‘’carregada’’ visível no gel de electroforese (agarose ou policrilamida), sendo que, todas as moléculas de DNA apresentam o mesmo tamanho. Por outro lado, caso o PCR não tenha sido eficiente será visível, no gel, uma sequência de bandas ( bandas de ‘’smear’’) .