Se quisermos obter uma determinada proteína a partir da molécula de DNA a clonar, tornasse necessário utilizar outros organismos para além da E. coli. Isto, levanta no entanto problemas, uma vez que, as técnicas de recombinação em organismo como leveduras são, usualmente, mais complicadas comparativamente ao uso em bactérias. Para resolvermos esta questão, surge oplasmídeo integrativo: plasmídeo que é recombinado num organismo e transformado num outro.
A presença do gene ori da E. coli, possibilita a construção do plasmídeo recombinante antes de ser transferido para as células de leveduras. Isto é, os genes são clonados nas bactérias (pela acção da mesma enzima de restrição, adicionamos o fragmento de DNA de interesse ao vector) e transformados em leveduras. Esta integração é conseguida pelo gene URA3 através de umarecombinação homóloga.
Para facilitar a transformação, as leveduras são utilizadas como protoplasto. Isto é, são cultivadas em meio de cultura sem a sua parede celular. Para além disto, apresentam o gene URA3 mutado (
Este vector integrativo apresenta:
- Gene URA3: este gene possibilita a recombinação homóloga entre o vector da bactéria e um cromossoma da levedura. No momento da recombinação homóloga, o cromossoma da levedura (ao alojar o plasmídeo recombinante) ficará com um locus para o URA3 funcional e outro mutado. As leveduras com o DNA recombinante (
- Gene que confere resistência à ampicilina e à tetraciclina: utilizados como marcas de selecção. Isto, permite diferenciar as bactérias que apresentam o vector plasmideal das que apresentam os plasmídeos normais, fazendo crescer as bactérias em meio rico em ampicilina e tetraciclina.
- Ori: permite que o gene seja replicado como DNA plasmideal na bactéria. Isto, vai permitir que a partir das sucessivas divisões de bactérias seja possível obtermos grandes quantidades do vector e, apartir disto, purifica-los para posteriormente transformá-los em bactérias.
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