"Sistema Nervoso" nas Plantas

Apesar das plantas não possuírem um sistema nervoso extremamente desenvolvido e organizado em diferentes tecidos e em sistemas, como no animais, estas tem apresentam a células nervosas: com a capacidade de inverter o potencial de membrana e produzir um potencial de acção. Este mesmo potencial de acção é extremamente importante, em organismos como a Mimosa pudica, de modo a produzirem-se respostas fisiológicas (como os movimentos násticos ou mesmo diversos trofismos).


O conceito de sistema nervoso em plantas, foi começado a ser trabalho por Burdon Sanderson (1873) e Charles Darwin (1875): descobriu potenciais de acção em folhas de Dionaea (“planta carnívora”). Com a utilização de eléctrodos em feixes condutores da planta, descobriram uma corrente eléctrica (causada pelas diferenças de potenciais eléctricos). Por sua vez, Sibaoka (1996) e Pickard (1973) afirmaram que os potenciais de acção (a tal corrente eléctrica já registada por Darwin) seriam utilizados em respostas fisiológicas. Para além disto, afirmou que os mesmos estímulos nervosos seriam de certa forma homólogos aqueles que ocorrem nas células nervosas dos animais. Foi já com Schroeder, Hedrich & Ferandez  (1984) que foi possível concluir que a formação desta "corrente eléctrica" (potenciais de acção) seriam responsáveis por montar e regular determinadas respostas fisiológicas desta a um dado estímulo do meio ambiente.


Mas afinal de contas, qual a importância de um sistema nervoso em plantas? A resposta surge de forma óbvia: para montarmos respostas fisiológicos extremamente rápidas que permitam compensar a falta de mobilidade da planta face ao meio ambiente (plasticidade metabólica). Um dado estímulo do meio-ambiente vai provocar a despncentração de uma dada hormona) será montada, resultando numa resposta fisiológica extremamente coordenada por parte de todo o organismo vegetal olarização (inversão da condutância iónica por parte de canais iónicos específicos) e assim formar um  potencial de acção que irá levar a informação do tal estímulo, a toda a planta. Após isto, a resposta efectora (por exemplo, o aumento da co- o potencial de acção funciona apenas como um "simples" e rápido mensageiro, sem apresentar a capacidade de por si só, resolver o "problema".


Este sistema nervoso das plantas, apresenta características extremamente semelhantes àquelas encontradas em animais, como algumas perfeitamente antagónicas. Apresentam um potencial limiar (responsável pela chamada lei do tudo ou nada), uma amplificação do sinal nervoso ao longo do organismo por processos vegetais (que não envolvem consumo de ATP) e a capacidade de uma comunicação célula-a-célula extremamente rápida, tal como nos animais. Por outro lado, as plantas apresentam um período refractário bastante mais longo que estes e os canais iónicos envolvidos não são os de Sódio e Potássio, mas os de Cálcio, Cloro e Potássio.


A comunicação nervosa, a nível "local", utiliza a via simplástica e a utilização dos plasmodesmos (integração metabólica) da mesma. Quando a resposta se quer mais generalizada, são utilizados os elementos crivosos dos vasos floémicos como meios de comunicação. De referir também que, nas células "sensores" (que recebem o estímulo) o estímulo para além de apresentar a necessidade de se apresentar com intensidade suficiente para ultrapassar o potencial limiar, deve ser duplicado (apenas possível num estímulo contínuo), o que permite a montagem de uma resposta fisiológica em situações de real importância.


No floema, os potencias de acção passam de elemento para elemento crivoso, utilizando transportadores iónicos específicos. Para além disto, é de extrema importância que os fotoassimilados apresentem pouca resistência a este impulso eléctrico. O facto mais interessante é que homologamente às bainhas de mielina nos neurónios animais, as células vegetais apresentam esclerênquima que restringe a passagem da informação nervosa das células de companhia para o floema (sendo feita apenas em "pontos" específicos).


Por fim, é importante referir que todo o processo é dependente da existência de canais iónicos nas células vegetais. Sendo esta capacidade de alterar a condutância iónica a determinados iões que permite produzir os tão importantes potenciais de acção. De referir também que a importância de grande quantidades citoplasmáticas de cálcio que irá obrigar este impulso a percorrer a via simplástica (devida à libertação destes pelos plasmodemos, utilizados na integração metabólica entre células distintas).

Potencial osmótico da Água

Podemos definir o potencial químico da água como a energia livre de um mol de água capaz de realizar trabalho, isto é, a medida de energia livre produzida por unidade de volume. Esta é influenciada pelos potenciais: osmótico, pressão e de gravidade.

• Potencial osmótico:

Este potencial representa o efeito de determinada concentração de solutos dissolvidos numa dada quantidade de água.

Podemos deduzir que o aumento da concentração de solutos diminui o potencial osmótico da água, uma vez que: os solutos reduzem a energia livre da água através da sua diluição. Como este potencial se relaciona directamente com o potencial químico da água, podemos afirmar que o aumento de solutos diminui o potencial osmótico químico da água.

• Potencial de pressão:

O potencial de pressão, representa o efeito da pressão a qual o sistema está sujeito e o valor pode ser negativo ou positivo:

Pressão positiva faz aumentar o potencial de pressão;

Pressão negativa faz diminuir o potencial de pressão e é denominada por tensão.

O movimento da água ocorre sempre de locais com pressão positiva para locais com pressão negativa (do maior potencial para o menor), isto é, a pressão tende sempre a compensar a tensão. Esta é a “regra” que faz a água circular pelo interior dos tubos xilémicos desde a raiz da planta (pressão positiva, pela entrada de água) até às folhas das mesmas (onde ocorre a chamada, tensão superficial causada pela transpiração foliar).

• Potencial de gravidade:

Reflecte o efeito da gravidade a que uma determinada solução está sujeita. Este potencial só tem real influência em árvores de grande porte. Como tal, a nível celular é desprezado para as considerações do potencial químico da água.

No solo, o principal componente da entrada da água na raiz é o potencial de pressão (o potencial do soluto só tem real influência em solos salinos). Este, será decrescente ao longo da planta, de modo a que o movimento da água seja ascendente (lembrar que, a água movimentasse sempre do maior potencial de pressão para o menor). Apenas respeitando estas considerações termodinâmica é que a planta consegue transportar eficazmente água sem consumir energia e sem um sistema de propulsão próprio.

Transporte de Água

O transporte de água é um transporte passivo, isto é, respeitando as leis da termodinâmica leva a que seja levada sempre para regiões de menor energia livre (para não termos de adicionar energia externa ao sistema biológico). Isto é, podemos dizer que os fluxos de água ocorrem sempre de zonas com maior energia potencial, para zonas onde essa mesma energia potencial é menor (processo espontâneo);

Podemos dividir o transporte em três diferentes tipos: diusão, fluxo em massa e osmose.

• Difusão:

Ocorre um movimento aleatório (Browniano) das moléculas de água , respeitando sempre um gradiente de concentração: da maior concentração de soluto, para a menor concentração. Isto é, há a tentativa do sistema, de forma passiva (sem consumo de ATP) , a atingir o equilíbrio químico no que toca à concentração do soluto em questão.

Podemos definir então que, a taxa de difusão é proporcional à diferença de concentração para um determinado soluto. Como tal, este será um mecanismo extremamente importante a pequenas distâncias, mas algo lento a distâncias longas.

• Fluxo em massa:

Ocorre o movimento de água mediante um gradiente de pressão, não existindo assim, o fornecimento de energia ao sistema, para que este movimento ocorra. Este é o principal mecanismo do transporte de  pelos vasos xilémicos da planta e, pelo qual, água vai desde as raízes (absorvida no solo) até aos diferentes tecidos vegetais.

• Osmose:

Este mecanismo, implica o movimento de água através de uma membrana, recorrendo aos gradientes de concentração e de pressão.

Em tecidos vegetais, este processo ocorre essencialmente com o auxílio das aquapurinas (conjunto de proteínas intrínsecas que funciona como um canal selectivo de moléculas de água).

Água: "Recurso chave" das células vegetais

A água é o principal constituinte das células vegetais. Ela é responsável por muitas reacções que nela ocorrem uma vez que se comporta como meio de reacção e como um excelente solvente, proporcionando assim o ambiente necessário para a movimentação das várias moléculas no interior das células. Para além disto, a água tem um papel importantíssimo em vários processos fisiológicos e estruturais como o crescimento e no alargamento celular, nas trocas gasosas nas folhas, em vários processos de transporte e até na estabilidade mecânica de tecidos não lenhificados (turgência das células vegetais).

Como tal, é necessário que os organismos vegetais (que ao contrário dos animais, não tem um sistema cardiovascular) façam chegar água a todas as partes do seu organismo com o consumo mínimo de energia. O que à primeira vista parece ser um complexo problema de termodinâmica revelasse uma manobra inteligentíssima que explora as características físico-químicas da água.

A água, é constituída por um átomo de Oxigénio e dois de Hidrogénio, por ligações covalentes formando uma molécula com a forma de um tetraedro (ângulo de 104,5˚ devido aos electrões não-ligantes do oxigénio). O átomo de Oxigénio é muito mais electronegativo do que os dois átomos de hidrogénio o que dá uma das características mais importantes desta molécula: assimetria eléctrica, ou seja, dipolo eléctrico.  Esta característica é responsável por:

• Atracções electrostáticas entre diferentes moléculas de água;
• Formação de pontes de hidrogénio;
• Bom solvente de grupos iónicos e de solventes polares: redução das repulsões electrostáticas das cargas das mesmas, aumentando assim a sua solubilidade (neutralização das cargas iónicas e das moléculas polares);
• Propriedades térmicas essências à vida;

PCR

Com avanço da tecnologia, novas técnicas de copiar o DNA foram surgindo, assim, em poucas horas e in vitro utilizando a técnica de PCR ( polimerase chain reaction ) é possível sinterizar grandes quantidades de um fragmento de DNA. Não se trata de um técnica substituta da clonagem, trata-se pois de um técnica ‘’complementar’’. Não consegue substituir a clonagem, uma vez que é dependente de um ‘’molde’’ previamente conhecido.
Posto isto, desta técnica resulta múltiplas cópias de uma região de interesse num fragemento de DNA. Trata-se duma técnica que não requer células vivas, uma vez que é realizada in vitro e apenas requer: Molde de DNA, primer, DNA polimerase ( Taq polimerase)e nucleótidos livres.
Uma das dificuldades nesta técnica seria arranjar uma polimerase que não desnaturasse à temperatura de desnaturação do DNA e por isso utiliza-se a Taq polimerase, uma polimerase extraída de T.aquaticus, um extremófilo.
E como ocorre a reacção?
1) Aumenta-se a temperatura da mistura (Molde de DNA, primer, DNA polimerase ( Taq polimerase)e nucleótidos livres) , no tubo de ensaio, até aos 94ºC: a esta temperatura, as pontes de hidrogénio que unem as duas cadeias de DNA, pelas bases azotadas são quebradas, originando duas moléculas de DNA em cadeia simples.
2) Baixa-se a temperatura até aos 50-60ºC: isto, vai permitir que os primers se liguem ao segmento (numa dada sequencia) a copiar.
3) Aumenta-se novamente a temperatura, desta vez, até aos 72ºC (T óptima da Taq polimerase: inicia-se a síntese do DNA) : Nesta primeira fase há a produção de ‘’produtos longos’’ a partir da cadeia de DNA .
[Oligonucliótidos cadeia simples longos ( produtos longos) : apresentam extremidades 5’ idênticas, mas extremidades 3’ aleatórias, isto é, a aleatoriedade das extremidades 3’ devem-se aos locais de fim de síntese de DNA, isto é, onde a reacção de polimerização pára! ]
4) Após o fim de um ciclo de desnaturação - anneling (renaturação)-sintese, os ‘’produtos longos’’ irão funcionar como moldes para mais um ciclo de PCR, originando ‘’Produtos pequenos’’.
[Podutos pequenos: As extremidades 5’ e 3’ são ditadas pelo local de ligação do primer, isto é, oligonucleótidos iguais e com fins iguais.
Ao longo de vários ciclos, o numero de ‘’produtos pequenos’’ que são cadeia de interesse, aumenta de forma exponencial.
Para que possamos verificar a eficiência do PCR recorremos à técnica de electroforese, ou seja, como o que se pretende é amplificar (copiar) um segmento específico de DNA, caso o PCR tenha sido bem feito, o resultado da electroforese será uma marca ‘’carregada’’ visível no gel de electroforese (agarose ou policrilamida), sendo que, todas as moléculas de DNA apresentam o mesmo tamanho. Por outro lado, caso o PCR não tenha sido eficiente será visível, no gel, uma sequência de bandas ( bandas de ‘’smear’’) .

Vector Shuttle: o plasmídeo integrativo

Se quisermos obter uma determinada proteína a partir da molécula de DNA a clonar, tornasse necessário utilizar outros organismos para além da E. coli. Isto, levanta no entanto problemas, uma vez que, as técnicas de recombinação em organismo como leveduras são, usualmente, mais complicadas comparativamente ao uso em bactérias. Para resolvermos esta questão, surge oplasmídeo integrativo: plasmídeo que é recombinado num organismo e transformado num outro.

A presença do gene ori da E. coli, possibilita a construção do plasmídeo recombinante antes de ser transferido para as células de leveduras. Isto é, os genes são clonados nas bactérias (pela acção da mesma enzima de restrição, adicionamos o fragmento de DNA de interesse ao vector) e transformados em leveduras. Esta integração é conseguida pelo gene URA3 através de umarecombinação homóloga.

Para facilitar a transformação, as leveduras são utilizadas como protoplasto. Isto é, são cultivadas em meio de cultura sem a sua parede celular. Para além disto, apresentam o gene URA3 mutado ( ), para ser possível separar as leveduras clonadas das não clonadas.

Este vector integrativo apresenta:

• Gene URA3: este gene possibilita a recombinação homóloga entre o vector da bactéria e um cromossoma da levedura. No momento da recombinação homóloga, o cromossoma da levedura (ao alojar o plasmídeo recombinante) ficará com um locus para o URA3 funcional e outro mutado. As leveduras com o DNA recombinante ( /URA3 e URA3/URA3) são assim separadas das leveduras onde não ocorreu recombinação homóloga ( / ), fazendo-as crescer em meio mínimo em uracilo (só as leveduras recombinantes vão conseguir dividir-se e crescer).
• Gene que confere resistência à ampicilina e à tetraciclina: utilizados como marcas de selecção. Isto, permite diferenciar as bactérias que apresentam o vector plasmideal das que apresentam os plasmídeos normais, fazendo crescer as bactérias em meio rico em ampicilina e tetraciclina.
• Ori: permite que o gene seja replicado como DNA plasmideal na bactéria. Isto, vai permitir que a partir das sucessivas divisões de bactérias seja possível obtermos grandes quantidades do vector e, apartir disto, purifica-los para posteriormente transformá-los em bactérias.

YAC’s ( Cromossomas Artificiais de Leveduras):

São cromossomas obtidos “artificialmente” a partir de plasmideos que se propagam em leveduras (como a S. cerevisiae) e representam a primeira tentativa para introduzir moléculas de DNA acima dos 50 pares de bases. Porém, estão associados a um enorme problema de estabilidade e a possibilidade de sofrerem rearranjos, originando novas combinações.

Um cromossoma é caracterizado por:

• Telómeros: sequências específicas que ditam o fim da molécula de DNA.
• Centrómeros: importantes na divisão celular.
• Origem de Replicação: ditam o inicio da replicação da molécula de DNA a cada divisão do cromossoma.

O YAC, apresenta:

• Local de ligação para enzima de restrição BamHI: como existe um local de ligação para esta enzima de restrição, após o corte na molécula circular, terá origem uma molécula de DNA linear.
• Gene URA3 e TRP: são genes presentes na biossíntese de compostos (Uracilo e Triptofano). Isto, irá funcionar como uma marca de selecção para separarmos as leveduras com os vectores das que não apresentam o vector. Isto é, ao fazermos as leveduras crescerem em meio mínimo de uracilo e triptofano e, uma vez que as leveduras sem o vector não apresentam os genes URA3 e TRP funcional, apenas irão crescer no nosso meio de cultura bactérias que contenham o vector (recombinante ou não).
• Gene SUP4 com local de ligação para a enzima de restrição: este gene será a marca de selecção para separar os vectores que contem os fragmentos de restrição dos restantes. Isto é, se cortarmos uma determinada molécula de DNA de interesse com a mesma enzima de restrição para qual o SUP4 possuí um local de ligação, estaremos a promover uma inibição por excerto. Isto é, com a inserção da sequência de interesse, o gene SUP4 irá perder a sua funcionalidade, sendo possível então por métodos colorimétricos diferenciar dos que tem o gene SUP4 activo (sem o fragmento de restrição).
• Ori: origem de replicação para que o cromossoma artificial tenha a capacidade de ser replicar a cada divisão da levedura.
• CEN4: origina o centrómero essencial para a correcta constituição do cromossoma.
• TEL: origina os telómeros que farão parte do cromossoma artificial.

Vectores de Bacteriófagos λ:

A quando o fenómeno da infecção (transfecção) do DNA do fago para o interior da bactéria, este pode seguir dois ciclos de vidas diferentes: ciclo lítico e ciclo lisogénico.

• Ciclo de vida lítico: o DNA ao ser transfectado para o interior da bactéria não irá sofrer a integração no genoma da mesma e, como tal, irá utilizar o metabolismo da bactéria para sintetizar proteínas que irão compor o fago. Isto, leva a que, ao fim de uma divisão celular ocorra a formação e a libertação (lise da célula) dos mesmos.
• Ciclo de vida lisogénico: o DNA ao ser transfectado será introduzido no genoma da bactéria e, como tal, será replicado ao longo das sucessivas divisões, juntamente com todo o material genético da bactéria (de geração em geração). Após isto, o ciclo de vida lisogénico é terminado pela utilização dos “processos” descritos no ciclo de vida lítico, resultando numa libertação massiva de bacteriófagos.

No ponto de vista da Eng. Genética, seria muito mais vantajoso se fosse possível direccionar o ciclo de vida para uma fase lítica, de forma a obter o máximo de fagos (com o DNA recombinante) no menor tempo possível. Isto é possível através da eliminação do gene que confere a incorporação do DNA do fago no genoma da bactéria, na sequência que representa o genoma do Bacteriófago λ. Esta técnica, para além de “direccionar” o ciclo de vida, torna possível a inserção de uma maior molécula de DNA (comparativamente aos vectores de plasmídeos).

O genoma de λ para além de ser uma molécula linear, apresenta fins coesivos (cos sites), característica “diagnóstica” do DNA viral. Como estas pontas apresentam propriedades coesivas, dependendo da forma como se liguem, podem originar: concatámeros (molécula de DNA linear) e os cósmidos (molécula de DNA circular).

Formação de concatámeros:

Como referido anteriormente, a molécula de DNA λ possuí a forma linear e, quando tratada com uma determinada enzima de restrição, será clivada originando “Left cos site” e um “Right cos site”. Por sua vez, se fizermos um corte na molécula que queremos recombinar, utilizando a mesma enzima de restrição e pela acção das ligases é possível formar: Left cos site – DNA interesse – Right cos site. Por sua vez, como cada sequência apresenta fins coesivos entre si, é possível originar um fragmento de DNA em que o gene que pretendemos clonar, surge de sob a forma de cópias múltiplas e sequencial, intercalado com os diferentes “cos site”:

Left cos site- DNA – Right Cos site – Left cos site – Right cos site – DNA – Left cos site

A propriedade “cos site” é de extrema importância na utilização do vector de bacteriófago, uma vez que, promove a formação espontânea de fagos in vitro a partir de proteínas que constitutem a cápsula (empacotamento in vitro.).

A quando do empacotamento in vitro ocorre uma clivagem do fragmento de DNA λ , de modo a que: todas as sequências de DNA que eles empacotem sejam recombinada (Left cos site – DNA – Right cos site) uma vez que a sequência Left cos site – Right cos site é pequena de mais para sofrer o empactomento. É então possível definir que um fragmento de DNA só pode ser empacotado in vitro se: conter em cada terminal um cos site e for composto por 37 a 52 pares de base.

Após a transfecção dos vírus para o interior das bactérias, devemos proceder ao plaqueamento da suspensão (bactérias + vírus) para uma placa de petri, formando assim uma camada homogénea de bactérias. Neste ponto, devemos ter em consideração que:

• Zonas onde não há formação de placas fágicas: não há presença do DNA λ, uma vez que, não ocorreu lise celular.
• Zonas onde há formação de placas fágicas: surgem como “pontuações” onde ocorre lise celular e, como tal, estaremos na presença de DNA λ. A partir destes discos “brancos” é possível extrair e purificar inúmeras cópias do DNA recombinante.

Formação de cósmidos:

O cósmido é uma molécula de DNA circular que é obtida a partir do genoma de λ. Isto é, os cos sites em vez de se complementarem com outros fins coesivos, após a recombinação com um fragmento de DNA de interesse (utilizando a mesma enzima de restrição em ambos os cortes) vão ligar-se entre si, formando uma molécula de DNA circular contendo o gene de interesse e um locus cos site.

Esta, como apresenta cos site pudera sofrer o empacotamento in vitro originando fagos λ contendo a moléucula de DNA circular “recombinada”. Porém, como esta molécula é de grandes dimensões não será tida em conta como um fragmento de DNA viral, sendo no entanto, mantida no citoplasma como DNA plasmideal.

De salvaguardar que, este plasmídeo é diferente do vector plasmídeal utilizado em bactérias, uma vez que apresenta a possibilidade de inserção de um fragmento de maiores dimensões comparativamente a um vector bacteriano.

Vectores bacterianos

Com a chegada das técnicas de engenharia genética surgiu a oportunidade de clonar genes de interesse utilizando organismos auto-replicantes. Para isto utilizam-se vectores que funcionam como transportadores de genes para o interior duma célula hospedeira.
E como funciona isto? Primeiro, utiliza-se um vector que transporta um gene para o interior de uma célula hospedeira (normalmente bactérias ou leveduras), seguidamente, dentro da célula hospedeira o vector multiplica-se, produzindo assim numerosas cópias de si mesmo, cópias essas que também incluem o gene adicionado. Posteriormente, aquando a divisão celular, a sua descendência recebe cópias do ADN recombinante, continuando depois a replicação de vectores. Por fim, após um grande número de divisões celulares, possui-se uma colónia de bactérias, em que cada uma delas possuiu uma ou mais cópias da molécula de ADN recombinante, e consequentemente do gene inserido.
Os primeiros vectores a ser ultilizado foram os plasmídeos circulares extracromossomicos de DNA existentes em bactérias.
Quais os requisitos para que possam ser utilizados como vectores?
- Devem possuir um gene que lhes confira resistência a um antibiótico (como Cloranfenicol e a Ampicilina) para que se possa seleccionar as bactérias que possuem o vector clonado.
-Devem possuir uma sequencia de DNA que actue como origem de replicação, de modo a que se possa replicar independentemente dos cromossomas bacterianos e desta forma ser possível criar cópias de si mesmo dentro da célula hospedeira.
- Deve possuir locais de reconhecimento para que enzimas de restrição o possam cortar.
Actualmente, os vectores bacterianos utilizados na clonagem de genes são comprados a empresas que os fabricam. Um exemplo destes vectores é o pUC8( neste caso, UC são as iniciais de quem criou o plasmidio). Este vector possui:

- Um gene resistente à ampicilina. Este gene permite-nos saber quais as bactérias que foi possível inserir o vector plasmidico.
- Uma origem de replicação.
- O gene lacZ’. Este gene codifica a enzima β-galactosidae e possui locais de restrição para várias endonucleases. Este gene permite-nos saber quais as bactérias que possuem o vector modificado com o gene de interesse a ele adicionado.
Assim, quando pretendemos clonar um gene, utilizando este vector, após ter-mos inserido o gene no plasmideo e posteriormente o plasmideo (Vector) na bactéria ( aumentando a temperatura que por sua vez aumenta a fluidez da membrana e adicionando Ca²⁺ de forma a neutralizar), colocamos as bactérias num meio com ampicilina, desta forma as bactérias que não possuem o vector irão morrer. Posteriormente adicionamos um composto: X-gal, em que bactérias que não possuem o gene que se pretende clonar irão degradar a o composto ‘’gal’’ sendo que o composto ‘’X’’( composto desconhecido, apenas as empresas que criam os plasmideos sabem qual o composto em questão) as colora de azul. Assim, as células que não forem coloradas, são as células que possuem o gene que pretendemos clonar.

As descobertas do DNA

Os primórdios da descoberta do DNA remonta a 1869, quando o físico Friedrich Miecher a partir de pus de ligaduras descartadas isolou uma ‘’molécula grande e rica em fosfato’’ que chamou de nucleína, uma vez que, esta residia no núcleo.

Posteriormente, em 1903, Phoebus Levene identificou os três componentes dos nucleótidos: a base, o açúcar e o fosfato. Mais ainda, sugeriu que o DNA era constituído por nucleótidos ligados pelo grupo fosfatos, no entanto, pensava que a cadeia era curta e que as bases azotadas se repetiam numa dada ordem.

Por esta altura, em que de descobria o que é actualmente aceite como a molécula da vida, várias dúvidas surgiam sobre qual seria a molécula responsável pelo armazenamento da informação genética. Tinha-se como grande hipótese as proteínas.

Em 1928, Fredrich Griffth, realizou uma experiência, na qual descobriu que existia algo – princípio transformante – que transformava uma bactéria não patogénica numa bactéria patogénica. Utilizou pneumococos (causadora de pneumonia), bactéria que existe em duas formas:
-Tipo S (patogénica) – Com cápsula, lisa, resistente à fagocitose.
- Tipo R (não patogénica) – Sem cápsula, rugosa, destruídas pela fagocitose.
Posto isto, realizou 4experiencias:

Situação 1: Injectou bactérias do tipo S num rato. O rato morre de pneumonia.
Situação 2: Injectou bactérias do tipo R num rato. O rato sobrevive, pois o seu sistema imunitário assegura a destruição deste tipo de bactéria.
Situação 3: Injectou bactérias do tipo S, mortas pelo calor, num rato. O rato sobrevive, pois o agente infeccioso encontra-se morto.
Situação 4: Injectou uma mistura de bactérias do tipo S mortas pelo calor e bactérias do tipo R vivas, num rato. O rato morre. Ao analisar o sangue do rato encontra bactérias do tipo R e do tipo S.
Assim, a hipótese que levantou, é que existiria algo que permitia às bactérias do tipo R adquirir a características patogénicas provenientes das bactérias do tipo S.

Passados uns anos, em 1945, Oswald Avery, intrigado sobre o que seria o tal ‘’principio transformante’’, cultivou células do tipo S e posteriormente matou-as com calor e provocou a lise celular, tendo em seguida separado componentes como glícidos, lípidos, proteínas e DNA. Pegou em cada um destes componentes juntamente com bactérias do tipo R e injectou num rato. O que verificou foi que apenas a mistura de DNA ( das bactérias do tipo S) + Bactérias do tipo R provocava pneumonia no rato, e que portanto, apenas esta mistura transformava bactérias do tipo R em bactérias do tipo S. Assim, para vincar a sua descoberta adicionou à mistura referida desoxirribonuclease (destrói o DNA), e verificou que nada acontecia, isto é, as bactérias do tipo R não se transformavam em bactérias patogénicas.
Conclui assim, que o DNA seria o ‘’principio transformante’’.

Em, 1952, Alfred Hershey e Martha Chase, realizaram experiencias com bacteriófagos ( vírus que infectam bactérias) . O vírus é apenas constituído por proteínas e ácido nucleico e apenas por duas partes: A cabeça e a cauda. A cápsula do vírus possui proteínas ricas em enxofre e o ADN existente no seu interior é rico em fósforo. A infecção por parte do virús dá-se quando este se agarra à bactéria com a cauda e injecta no seu interior algo que irá controlar, apartir do citoplasma bacteriano, a formação de mais vírus.
Nesta experiencia, para saberem o quê que entrava para dentro da bactéria e que controlaria a formação de novos vírus, utilizaram enxofre radioactivo (35S) e fósforo radioactivo (32P ) .Realizaram então duas experiencias:
Experiencia 1:Cultivaram bacteriófagos em meio que continha enxofre radioactivo, que posto isto ficaram com as proteínas radioactivas. Posteriormente estes vírus infectaram bactérias não radioactivas. Observaram então, que a radioactividade permanecia no exterior das bactérias.
Experiencia 2: Cultivaram bacteriófagos em meio que continha fósforo radioactivo, que posto isto ficaram com os ácidos nucleicos radioactivos. Posteriormente estes vírus infectaram bactérias não radioactivas. Observaram então, que a radioactividade se encontrava no interior das bactérias.
Concluíram assim que, sendo o DNA viral que entra para o interior da bactérias, então seria ele que teria informação para comandar o fabrico de novos vírus.

Agora que já se sabia qual a molécula responsável pela transmissão da informação genética, pretendia-se saber como seria a estrutura dela, e de que forma ela funcionaria.
Assim, em 1953, JamesWatson e Francis Crick propuseram o que é actualmente conhecida como a estrutura da molécula de DNA. Baseados em imagens de difracção de Raio-x obtidas por Rosalind Frankin e nas conclusões de Erwin Chargaff acerca da relação entre as bases azotadas ( T+C = A+G), propuseram o modelo de dupla hélice do DNA. Este modelo sugeria que:
- O DNA possui duas cadeias helicoidais sim que se enrolam num mesmo eixo formando uma dupla hélice.
- o esqueleto hidrofílico ( desoxirribose e grupos fosfato carregados negativamente) encontra-se na parte externa da dupla hélice, voltados para a agua circundante.
- o esqueleto hidrofóbico ( a bases purinas e pirimidicas) está voltado para dentro da dupla hélice.
- o emparelhamento das duas cadeias cria um sulco maior e um sulco menor na superfície da dupla hélice.
- cada uma das cadeias está emparelhada com a outra cadeia, unidas por pontes de hidrogénio entre as bases azotadas ( Citosina e Guanina formam três pontes de hidrogénio e Timina e Adenina formam duas pontes de hidrogénio).
- as cadeias de DNA da estrutura em dupla hélice são antiparalelas, isto é, à extremidade 5’ de uma das cadeias corresponde a extremidade 3’ da outra cadeia.

Clonagem

De uma forma generalista, podemos designar por clonagem a inserção de uma molécula de DNA de um organismo noutro organismo diferente. Como tal, surge a necessidade de definirmos o que se trata de DNA recombinante.

O DNA recombinante resulta da habilidade de controlar técnicas de biologia molécular (cortes por enzimas de restrição e ligases) de modo a criar uma molécula de DNA “manipulada”. Podemos definir o DNA recombinante como uma molécula de DNA resultante de duas completamente distintas.

Uma sequência de um gene animal, por exemplo, e um plasmídeo são tratados com a mesma enzima de restrição. Isto, vai resultar na formação de fins coesivos “complementares” entre as diferentes moléculas de DNA. De seguida, pela acção de ligases é possível criar ligações fosfodiester estáveis entre os dois genes e criar assim uma única molécula de DNA (a partir dos dois fragmentos).

De seguida, esta molécula de DNA recombinada e circular pode ser transferida (transformada) para o interior de um organismo (uma bactéria, por exemplo) de modo a ser replicada e aumentar o seu número. Se, plaquearmos esse mesmo microorganismo, irão originar-se colónias (por divisões a partir de um único organismo) na qual poderemos obter grandes quantidades do gene recombinado.

Podem procurar mais informação em: T.A. Brown: Genomes 3, Garland Science.

DNA Ligase

As DNA’s ligases são enzimas que apresentam a capacidade de formar ligações fosfodiester estáveis entre diferentes nucléotidos (entre o Carbono 5 de um e o C3 do seguinte), com o consumo de ATP (ou outro composto com três fosfatos como: GTP,CTP e TTP), tornando a reacção termodinâmicamente favorável. De salvaguardar que, por razões de estabilidade, a acção desta enzima é favorecida quando o substrato é composto por duplas cadeias de DNA.

Estas enzimas, tem a capacidade de funcionar numa única molécula de DNA e ligar as duas extremidades da mesma, formando uma molécula de DNA circular. Por outro lado, tem a capacidade de ligar dois fragmentos distintos de DNA (sendo muito utilizado para a formação de DNA recombinante).

A aplicação desta enzima é copulada à acção das enzimas de restrição (“copy past” molecular), uma vez que as DNA ligases tem a capacidade de ligar dois cortes produzidos pela mesma enzima de restrição. Contudo, uma vez que as DNA’s ligases não apresentam a capacidade de “carregar” os fragmentos de DNA e manter-los em posições favoráveis para criar as ligações fosfodiester entre os diferentes nucleótidos, a sua acção tenderá a ocorrer mais facilmente fragmentos de DNA coesivos (por estarem fisicamente próximos por complementaridade de bases “transitórias”) do que em fins lisos (“blunt-ends”).

Como nem sempre é possível obtermos fragmentos de DNA com fins coesivos (pela acção de uma enzima de restrição), tiveram de ser criadas formas de, indirectamente, converter os fins lisos a fins coesivos: Modificadores terminais.

• Linkers: fragmentos de DNA de cadeia dupla na qual estão contidos locais de ligação (sequências de nucleótidos específicas) para uma dada enzima de restrição. Se, utilizarmos as DNA ligases para ligar os “linkers” aos blunt-ends e, de seguida, aplicarmos a enzima de restrição para o qual o linker tem um local de ligação, o nosso fim liso será “convertido” a um fim coesivo.
• Transferase Terminal de Desoxinucleótidos: produz caudas “homopoliméricas” (compostas pelo mesmo tipo de nucleótidos) à extremidade 3’ do blunt-end. É designada por “cola molecular”, uma vez que por complementaridade de bases, apresenta a capacidade de emparelhar com diferentes caudas homopoliméricas.
• Fosfatase Alcalina: remove grupos fosfatos na extremidade 5’ de um determinado fragmento de DNA. É de extrema importância, uma vez que pode “regular” a actividade da DNA ligase. Isto é, se no C5 de um determinado nucleótido estiver presente um grupo fosfato, a DNA ligase não vai conseguir formar uma ligação fosfodiester estável entre dois fragmentos de DNA.
• Cinase Nucleótidica T4: faz precisamente a reacção inversa da fosfatase alcalina (adição de grupos fosfato ao C5 de um nucleótido terminal).

Podem procurar mais informação em: T.A. Brown: Genomes 3, Garland Science.

Nucleases: Endonucleases (Enzimas de restrição)

As nucleases são enzimas conhecidas por degradas ligações fosfodiester (PO4-) entre nucleótidos. Estas, dependendo de onde façam o corte, podem ser divididas em endonucleases ( corte interno) e exonucleases (corte externo).

Das endonucleases, as mais conhecidas são as enzimas de restrição. Estas enzimas são proveninentes do sistema de defesa de bactérias e são utilizadas a quando a infecção das mesmas por DNA estranho de um bacteriofago (clivando-o).

As enzimas de restrição reconhecem e ligam-se a sequências específicas de enzima para enzima! Isto, é de extrema importância e permitide dividir estas enzimas em dois tipos:

• Tipo I e III: Fazem cortes pouco rigorosos. Por norma, o corte acontece um pouco à frente ou atrás do local de ligação.
• Tipo II: Fazem cortes bastantes específicos, normalmente, no local onde ocorre a ligação da enzima. Isto torna-as vantajosas, uma vez que permite prever o corte das mesmas.

Para além disto, as enzimas de restrição podem formar dois tipos de cortes nas sequências terminais:

• Blunt-ends: os chamados fins lisos! Isto é, logo após o corte da molécula de DNA em dois fragmentos pela enzima de restrição (quebra de ligações fosfodiester) e, uma vez que os dois fragmentos não apresenta complementaridade de bases entre si, em solução estes vão ficar fisicamente separados entre si.

• Sticky-ends (fins coesivos): a enzima ao fazer o corte cria "overhangs" (fins protuberantes) dando a capacidade aos dois fragmentos que criem complementaridade de bases (por pontes de H.) entre si. Isto, permite que mesmo com as ligações fosfodiester quebradas, consigam ficar fisicamente próximas num tubo de ensaio.

Apesar de cada enzima de restrição ter uma sequência própria de ligação de enzima para enzima, podem ser criados os mesmos fins protuberantes a partir de enzimas diferentes. Para além desta característica importante, devemos salvaguardar a actividade “polindrómica” destas enzimas. Isto é, independentemente da orientação da cadeia de DNA (5’-3’ ou 3’-5’) o corte será feito sempre na mesma zona (sequência de nucleótidos específica).

Podem procurar mais informação em: T.A. Brown: Genomes 3, Garland Science.

DNA’s Polimerases

Enzimas que formam fragmentos de DNA a partir de um molde pré-existente, por complementaridade de bases.

Estas, dependem dos primers (iniciadores moleculares) : oligonucléotidos de 20 nucleótidos de cadeia dupla, ao qual a enzima polimerase se liga para começar a sintetizar a nova molécula.

[Desenhar Primer]: Como o primer se liga, por complementaridade de bases à molécula de DNA imediatamente logo ao local a copiar, podemos elaborar um primer (conjugando os pares de bases) para que este se ligue a uma sequência específica, imediatamente antes da sequência de interesse.

As polimerases só constroem do 5'-3', respeitanto sempre o antiparalelismo característico da molécula de DNA.

Podemos dividir as Polimerases em dois tipos: as que não tem a capacidade de corrigir erros de montagem e as que possuem actividade exonucleásica:

· As primeiras, Polimerase 5'-3': só tem a capacidade de sintetizar a molécula, não podendo assim corrigir algum erro associado ao processo;

· As que possuem actividade exonucleásica podem ser divididas em dois tipos:

• 3'-5' actividade exonucleásica: montam do mesmo lado que desmontam (proofreading). Isto é, montam e verificam (avançam ou reparam)! Sempre que ocorre um erro é eliminado nucleótido a nucleótido.
• 5'-3' actividade exonucleásica: a correcção ocorre no lado oposto à montagem! Isto é, a enzima primeiro monta e depois retorna ao inicio para corrigir possíveis erros! O erro leva ao corte de uma sequência de nucleótidos.

A última actividade exonucleástica não tem interesse na engenharia genética e nas técnicas de DNA recombinante, uma vez que a cadeias nucleótidica criada seria prontemente degradada pela acção da enzima.

Alguns exemplos de Polimerases:

Polimerase I (E. Coli): apresenta as actividades exonucleásica 3'-5' e 5'-3'! Não é de grande utilidade para as técnicas de engenharia genética (devido à ultima actividade exonucleásica).

Klenow Polimerase: A enzima apresenta a subunidade que lhe confere a actividade exonucleásica 5-3 clivada, desactivando esta função. Como tal, torna-se perfeitamente aplicável as técnincas de eng. Genética.

Sequenase: utilizadas na técnica de sequênciação de DNA;

Taq Polimerase: proveninentes do Thermophilus Aquaticus, um extremófilo, apresenta uma enorme capacidade de resistência a temperaturas de desnaturação! É utilizada no PCR, por preservar a sua funcionalidade mesmo em altas temperaturas.

Podem procurar mais informação em: T.A. Brown: Genomes 3, Garland Science.