DNA Ligase

As DNA’s ligases são enzimas que apresentam a capacidade de formar ligações fosfodiester estáveis entre diferentes nucléotidos (entre o Carbono 5 de um e o C3 do seguinte), com o consumo de ATP (ou outro composto com três fosfatos como: GTP,CTP e TTP), tornando a reacção termodinâmicamente favorável. De salvaguardar que, por razões de estabilidade, a acção desta enzima é favorecida quando o substrato é composto por duplas cadeias de DNA.

Estas enzimas, tem a capacidade de funcionar numa única molécula de DNA e ligar as duas extremidades da mesma, formando uma molécula de DNA circular. Por outro lado, tem a capacidade de ligar dois fragmentos distintos de DNA (sendo muito utilizado para a formação de DNA recombinante).

A aplicação desta enzima é copulada à acção das enzimas de restrição (“copy past” molecular), uma vez que as DNA ligases tem a capacidade de ligar dois cortes produzidos pela mesma enzima de restrição. Contudo, uma vez que as DNA’s ligases não apresentam a capacidade de “carregar” os fragmentos de DNA e manter-los em posições favoráveis para criar as ligações fosfodiester entre os diferentes nucleótidos, a sua acção tenderá a ocorrer mais facilmente fragmentos de DNA coesivos (por estarem fisicamente próximos por complementaridade de bases “transitórias”) do que em fins lisos (“blunt-ends”).

Como nem sempre é possível obtermos fragmentos de DNA com fins coesivos (pela acção de uma enzima de restrição), tiveram de ser criadas formas de, indirectamente, converter os fins lisos a fins coesivos: Modificadores terminais.

• Linkers: fragmentos de DNA de cadeia dupla na qual estão contidos locais de ligação (sequências de nucleótidos específicas) para uma dada enzima de restrição. Se, utilizarmos as DNA ligases para ligar os “linkers” aos blunt-ends e, de seguida, aplicarmos a enzima de restrição para o qual o linker tem um local de ligação, o nosso fim liso será “convertido” a um fim coesivo.
• Transferase Terminal de Desoxinucleótidos: produz caudas “homopoliméricas” (compostas pelo mesmo tipo de nucleótidos) à extremidade 3’ do blunt-end. É designada por “cola molecular”, uma vez que por complementaridade de bases, apresenta a capacidade de emparelhar com diferentes caudas homopoliméricas.
• Fosfatase Alcalina: remove grupos fosfatos na extremidade 5’ de um determinado fragmento de DNA. É de extrema importância, uma vez que pode “regular” a actividade da DNA ligase. Isto é, se no C5 de um determinado nucleótido estiver presente um grupo fosfato, a DNA ligase não vai conseguir formar uma ligação fosfodiester estável entre dois fragmentos de DNA.
• Cinase Nucleótidica T4: faz precisamente a reacção inversa da fosfatase alcalina (adição de grupos fosfato ao C5 de um nucleótido terminal).

Podem procurar mais informação em: T.A. Brown: Genomes 3, Garland Science.